贾万忠人体带绦虫病诊断方法的研究进展2

摘要：就目前用于人体带绦虫感染或寄生的常用临床诊断方法，如虫体形态学观察、粪便或肛门拭子涂片显微镜检查、循环抗体ELISA检测、粪抗原ELISA和粪DNA-PCR检测等及其优缺点进行了综述。敏感性高且特异性强的粪抗原ELISA和粪DNA分子生物学检测是今后的发展方向和应重点研究的领域。

囊尾蚴病(cysticercosis)是由隶属于扁形动物门绦虫纲带科带属的猪带绦虫（Taeniasolium）、牛带绦虫(T.saginata)和亚洲带绦虫(T.asiatica)的中绦期幼虫（蚴）寄生于人和动物引起的一类重要的人畜共患寄生虫病，其流行广泛，危害严重。人是这些带绦虫的终末宿主和唯一传染源。成虫寄生于人体小肠引起带绦虫病(taeniasis/taeniosis)。

猪带绦虫病分布最广，除伊斯兰国家或地区外，几乎呈世界性分布，中非、南非、南美洲、中北美洲和亚洲的一些发展中国家发病率较高；在我国，该病散发于华北、东北、西北一带，地方性流行区仅见于云南。

牛带绦虫病也呈世界性分布，尤其以非洲、美洲、亚洲流行严重，也见于多数欧洲国家；在我国，该病流行于西南各省及西藏、内蒙古、新疆等。

亚洲带绦虫病见于东亚、东南亚诸国的一些山区及远海岛屿；在我国，该病流行于云南、贵州一带。带绦虫病的流行与饮食习惯及猪、牛饲养管理方法不当有密切关系。带绦虫病可导致患者腹胀、腹痛，消瘦、乏力等症状，而且使患者成为囊尾蚴病的传染源或者猪囊尾蚴病自体感染的受害者。

这3种带绦虫在亚太地区同时存在，对人体绦虫感染作出准确的鉴别诊断显得十分必要。因此，人体带绦虫病的诊断不仅有助于及早发现患者，对患者进行治疗，而且对有效控制囊尾蚴病的流行具有十分重要的意义。目前，已有多种方法用于人体带绦虫病的临床诊断，这些方法包括询问患者病史及生活和饮食习惯、粪便或肛门拭子涂片(perianaladhensivetapetest)形态学或显微镜检查、粪抗原和循环抗体ELISA检测、粪虫体DNA分子生物学检测技术等。

1询问绦虫携带者病史

牛带绦虫和亚洲带绦虫感染者通常可自发排出节片，而猪带绦虫携带者的节片是被动排出的（和粪便一起排出）。这是因为牛带绦虫和亚洲带绦虫的孕节活动能力强，常自肛门逸出，因而除了在粪便中发现排出的节片外，脱落的孕节也许可以在患者的内衣或住过的床上找到。因此，询问患者病史及是否来自疫区可以作为牛带绦虫和亚洲带绦虫感染或者流行病学调查的一种辅助诊断手段。询问患者是否有生食或半生食“米肉”、动物肝等不良生活习惯对发现带绦虫病人有一定价值。但对病人确诊需要进行粪便虫卵、虫体检查和驱虫试验等。确诊在于从粪便中检获孕节、虫卵或完整虫体。

2虫体形态学检查

2.1孕卵节片的检查

这3种带绦虫的孕卵节常从链体脱落，随呕吐物或粪便排到体外。观察孕节内子宫分支数目与形状可用于鉴定绦虫种类。可将混在粪便中的节片挑出并用清水洗净，夹于两载玻片之间，对着光线通过肉眼即可分辨子宫分支数目与形状。为了便于计数，可以用注射针将染料如洋红或墨水注射在节片内。也可对组织进行纵向切片和苏木素一伊红染色，以便更准确地对子宫分支进行计数。牛带绦虫孕节子宫每侧分支数为15～30个，分支较整齐：亚洲带绦虫与牛带绦虫相似，但孕节后缘有突出物，子宫侧枝上有更多的分支。猪带绦虫孕节子宫每侧分支数为7～13个，呈树枝状，分支不整齐。在大多数情况下，猪带绦虫和牛带绦虫的孕节能通过子宫的分支进行区分。然而，有时分支数目可能会发生重叠，例如子宫分支数在11～16时建议使用分子生物学方法等进行鉴别。牛带绦虫和亚洲带绦虫的孕节形态相似，有时会造成两者的混淆，此时也需要用分子生物学方法进行进一步确诊。

2.2头节和成节检查

用南瓜子、槟榔合剂等驱虫后24h，留取全部粪便检查头节可帮助考核疗效和鉴别虫种。可将粪便置于一大容器中用清水反复漂洗直至粪液澄清，将沉渣转到玻璃容器中并衬以黑色背景，仔细查找头节。如遇虫体纠结应小心解开并顺链体向细端查找。牛带绦虫的头节呈近四方形，较大而无顶突与小钩；亚洲带绦虫与此相似，但头节上有顶突；猪带绦虫头节呈圆形，较小且具顶突，其上有两圈小钩。头节被驱出表明治疗彻底。如有多条绦虫感染，应注意链体数目与头节数是否一致。

尽管从理论上讲，人们能通过猪带绦虫、牛带绦虫和亚洲带绦虫头节和成节所具有的典型形态特点明确区分这3种绦虫，但是多数驱虫药对头节形态有明显的影响，有时会改变头节的形态结构，从而造成不能完全根据头节上是否有钩来鉴别这3种带绦虫的现象。

成节需要固定和染色才能检测到卵巢的分叶和阴道括约肌，过程繁琐，尤其在应用Morgan和Hawkins描述的染色过程时更是如此。成节染色标本为近方形，雌雄生殖器官各一套，卵巢呈分叶状，猪带绦虫卵巢分左右两叶及中央小叶，牛带绦虫和亚洲带绦虫分左右两叶。但在实际工作中有时单从成节很难进行鉴别或者出现判断错误。

2.3虫卵检查

带绦虫患者的粪便检查包括肉眼检查和显微镜检查。能从患者排出的粪便中检出脱落的孕节，但节片排出是不定时的，并不是在每次排出的粪便中都能出现。因此，需要进行多次复检。此外，当用显微镜复检时，检出虫卵的机会将大为增加。

可使用多种方法如沉淀法等对粪便中的虫卵进行富集和浓缩以提高检出率。也可应用透明胶纸或肛门拭子法检查虫卵。使用透明胶带粘取肛周皮肤区域的绦虫虫卵，此法也被称为Granham法。牛带绦虫肛门拭子法比单一的粪便检查更为敏感，对猪带绦虫虫卵检查也可考虑采用此法。

但是，从总体上看，无论是通过粪便中虫卵形态学检查，还是通过节片、头节等形态学观察和比较来诊断带绦虫感染均缺乏敏感性。再者，带绦虫卵、头节、节片在形态学上极为相似，虽然从理论上讲能将各种绦虫分开，但在实际操作中常不能对虫种作出明确或准确的鉴别诊断。业已证明，驱虫治疗性诊断比询问病史的方法和粪检法更有效，能提高绦虫携带者的检出率。因此，在临床上或流行病学调查中常将这些方法结合起来进行综合诊断。在驱虫前后，清洗肠道有利于吸附于肠道黏膜虫体的排出，并能保持虫体的完整性，这将有助于虫种的鉴别。

3酶电泳分析法

LeRiche等报道了用酶电泳法分析包括感染人体猪带绦虫和牛带绦虫在内的多种带科绦虫腺苷酸激酶(AK)、谷氨酸脱氢酶(GLDH)、己糖激酶(HK)、苹果酸脱氢酶(MDH)、葡萄糖磷酸异构酶(GPI)同工酶等酶活性来鉴定和鉴别带绦虫虫种，表明不同种之间这些酶活性或同工酶酶谱存在差异，可用于绦虫虫种鉴定，其中GPI同工酶酶谱电泳分析技术比染色法快而且简单，尤其适用于不能直接用形态学观察法鉴定和区别虫体样本的情况。然而，它要求样品为新鲜或者冷冻材料。传统方法如乙醇或福尔马林保存的样品会破坏酶的活性，不能应用此方法对其进行鉴定和分析。

4免疫学检查

4.1血清学方法

目前已经证实，可通过带绦虫种属特异性循环抗体检测来诊断人牛带绦虫感染或寄生。检测原理是利用虫体排泄分泌物作为抗原检测患者血清特异性抗体。在32.7～42.1ku之间抗原分子对牛带绦虫感染患者的血清抗体具有很强的特异性反应，对其他寄生虫感染包括棘球属和缩小膜壳绦虫等无交叉反应性。用虫体匀浆物或虫体蛋白质作为抗原进行皮内试验、环状沉淀试验、补体结合试验或乳胶凝集试验可检测患者体内的抗体，阳性符合率为73.7%～99.2%。这种检测方法的最大优势不仅在于能进行种属的特异性诊断，而且还能避免处理粪便对检测者带来感染的危险，但缺点是清除肠道绦虫感染之后很长时间内血清抗体仍呈阳性，因此不能区分现症感染和既往感染，也不能对驱虫疗效进行评价。

4.2粪抗原检测

近年来，通过对人和动物粪便虫体抗原的检测来诊断绦虫感染的免疫学方法得到了很大发展，已逐渐用于临床诊断和流行病学调查。其原理是虫体寄生于宿主小肠内，其代谢物、分泌物、节片、虫卵等虫体组织（统称粪抗原）可随宿主粪便排到体外；再利用抗原-抗体特异结合的原理，通过制备特异抗体来检测粪抗原。目前，尚无人带绦虫粪抗原ELISA商品化试剂盒，但是可以参考犬科动物棘球绦虫粪抗原ELISA试剂盒的方法研发相应的试剂盒，关键在于解决抗原种特异性问题。利用抗牛带绦虫体细胞抗原的超免疫兔血清抗体ELISA法检测粪抗原，其敏感性比显微镜检查至少增加2.6倍。未固定的粪抗原样品能在室温下稳定保存数周，也能在低温条件下稳定存放较长时间。如用化学药品如福尔马林固定后，粪抗原标本可在室温或普通冰箱中保存一年。此外，粪抗原能在绦虫感染后不久即可持续检测到，在驱虫治疗后不久就会消失。粪抗原检测法显示了它良好的应用前景，可使用常规的液相ELISA法，灵敏性可达%，也可使用试纸条法。粪抗原检测与其他肠道蠕虫包括蛔虫属、鞭虫属、莫尼茨属等感染无交叉反应。目前，国外学者正在研制能用于鉴别带绦虫感染的粪抗原检测方法。

5分子生物学(粪虫体DNA)检查方法

为了克服用形态学和同工酶电泳方法鉴别绦虫的局限性，各种新的分子生物学方法已愈来愈多地应用于绦虫感染的诊断和流行病学调查。自从在人粪便中预先混入牛带绦虫虫卵后再用PCR技术检测粪DNA以来，该技术已得到了极大改进。

粪虫体和虫卵DNA检测的目标基因包括核糖体DNA(rDNA)如18SrDNA、ITS1(内转录间隔区1)、ITS2（内转录间隔区2）等，线粒体DNA(mtD-NA)如细胞色素氧化酶亚单位1(C01)、乳酸脱氢酶亚单位1(NDl)，高度重复序列等。这3种带绦虫线粒体基因组DNA全序列已测定完成，牛带绦虫和亚洲带绦虫核苷酸序列差异为4.6%，它们与猪带绦虫线粒体基因组序列的差异为11%。与此同时，带绦虫基因组计划也正在实施。这都为PCR扩增目标基因的选择和引物设计等提供了重要依据，为粪-DNA检查试剂盒的开发奠定了坚实的基础。

5.1常规分子生物学检测技术

常规的分子生物学试验方法主要包括DNA探针杂交技术、限制性酶切片段长度多态性(RFLP)、聚合酶链反应(PCR)、RFLP-PCR、随机扩增片段长度多态性-PCR(RAPD-PCR)、单链构象多态性(SSCP)、多重PCR、巢式PCR、核苷酸序列测定等。这些方法不仅特异性强，而且敏感性也较高。

DNA-DNA斑点印渍法（杂交法）可用于检测带绦虫卵，但耗时、复杂且相对不敏感。近年有用PCR扩增粪便中虫卵或虫体脱落的外被体表物质的微量种特异性DNA序列，以检测人体内带绦虫，特异性与灵敏性均很高，为带绦虫DNA诊断提供了一种快速、灵敏的方法。以PCR为基础的技术如常规PCR、RFLP-PCR、RAPD-PCR，SSCP、多重PCR等不仅能够明确鉴别出牛带绦虫、亚洲带绦虫和猪带绦虫的感染，而且检测不依赖于有完整的虫体形态，适合于新鲜、冷冻或用乙醇保存的寄生虫材料等。

粪DNA检测方法也存在一些缺点：从粪内分离纯化DNA较费力，试验操作需要一些较昂贵的仪器设备，同时要求操作人员具有较高的专业技术水平。在实际应用中，先用粪抗原检测法进行初筛，然后再用DNA检测法对粪抗原检测为阳性的样品进行确诊。人们已研发了多种从人粪便中提取带绦虫DNA的方法并用于带绦虫的PCR扩增和分析，以PCR方法为基础的检测技术不仅敏感性高，而且对患者感染后不久虫体发育处于早期阶段尚未达到性成熟和形成孕节前的种属进行鉴别是这种检测方法的优势。随着粪DNA检测方法的广泛使用，一些专门用于粪DNA分离和纯化的试剂盒将会涌现，这将为粪DNA检测提供极大便利。

5.2新型分子生物学检测技术

Yamasaki等和Anantaphruti等应用碱基切除序列扫描胸腺嘧啶核苷阅读分析[baseexcisionsequencescanningthymine-base(BESST-base)readeranalysis]方法，通过对col和细胞色素氧化酶b基因(cob)片段中特定位点上的胸腺嘧啶核苷酸碱基(T)的扫描可准确鉴别出这3种带绦虫，并可对猪带绦虫的两种基因型作出鉴别。该方法可以对用福尔马林保存的样品标本进行鉴定，这极大地方便了样品的保存和处理，降低了操作者被感染的危险。环介导等温扩增技术(loop-mediatedisothermalamplification,LAMP)也已逐渐用于宿主粪便、土壤和水源等寄生虫DNA的检测，该法快速、简便（如不需要PCR扩增仪，只需要一个恒温水浴锅即可）、灵敏，适宜于现场大规模流行病学调查和基层推广，显示了良好的应用潜力。Nkouawa等以组织酶L一半胱氨酸蛋白酶基因(clp)和col为目标靶，利用LAMP技术再结合限制性内切酶分析方法可以有效检测和鉴别人体粪便中的猪带绦虫、牛带绦虫和亚洲带绦虫，敏感性达到能从每克粪便中检出1个拷贝的目标基因或者5个虫卵的水平。

6结语

带绦虫感染患者是人和动物囊尾蚴病的唯一传染源，控制人体带绦虫感染是预防人畜囊尾蚴病的关键和中心环节。及时、准确检测绦虫感染者，并对其进行及时驱虫即可有效切断带绦虫循环链。近年来已经对许多抗原、抗体监测方法进行了试验，虽然目前尚未开发出能用于人体绦虫感染检测并可在流行病学调查中推广应用的简便常规检测方法，但是有关这方面的研究已取得了一些重要突破。研究表明，敏感而特异的带绦虫粪抗原或者粪DNA检测将成为带绦虫病诊断行之有效的方法，是这一领域未来研究和发展的新方向。

(文章来源：;40(02)中国兽医科学贾万忠等参考文献略)

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